A.差速離心:逐次增加離心力,每次可沉降樣品溶液中的一些組份。
差速離心是一種常用的方法。在這種方法中,離心管在開(kāi)始時(shí)裝滿(mǎn)了均一的樣品溶液。通過(guò)在速度下時(shí)間的離心后,就可得到兩個(gè)部份:沉淀和上清液。
通常在次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心,把所需的粒子沉積下來(lái)。離心的時(shí)間要選擇得當,使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心,直到達到所需要的分離純度為止。
差速離心的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,但分離純度不高。
B.密度梯度離心法:可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離,具有很好的分辨率。
1)速率區帶法(rate zonal):
根據樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下:
在離心管中裝入密度梯度溶液,溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。
將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負梯度。
由于不同大小的粒子在離心力作用下,在梯度中移動(dòng)的速度不一樣,所以經(jīng)過(guò)離心后會(huì )形成幾條分開(kāi)的樣品區帶。
注意:樣品粒子的密度大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過(guò)程在區帶到達管子底部前停止。
2)等密度離心法(isopycnic):
根據粒子的不同密度來(lái)分離。離心過(guò)程中,粒子會(huì )移至與它本身密度相同的地方形成區帶。
密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后,樣品粒子達到它們的平衡點(diǎn)。注意:平衡后粒子的分離由其密度決定,與時(shí)間無(wú)關(guān),此時(shí)再改變離心轉速,只能改變區帶的相對位置。 2.密度梯度分析法
1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇:
A、應具備的性質(zhì) :
梯度物質(zhì)的選擇原則是滿(mǎn)足分離方法的基本要求,一個(gè)理想的密度材料標準它應是:
· 所形成的溶液密度應包括所需要的密度范圍。
· 具有某些性質(zhì),如折射率,據此可測定它的濃度。
· 所形成的溶液粘度低。
· 不損傷所分離的樣品。
· 離心分離后容易除去。
· 不妨礙分離積分的分析。
B、常用介質(zhì)種類(lèi):
表一、常用梯度材料在20℃密度
B.梯度介質(zhì)應用范圍:
表二、等密度梯度介質(zhì)的應用
+++很好 ++好 +可以 --不適用
表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度
(2)、梯度溶液的準備:
計算
稀釋(本文第三章部分)
(3)、梯度形狀
梯度形狀分:線(xiàn)型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數梯度。(如下圖)
梯度形狀對于分離是否成功重要:
常用的是線(xiàn)型梯度,適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續或階梯型梯度適用于分離整細胞、亞細胞組分以及純化一些哺乳類(lèi)動(dòng)物病毒或昆蟲(chóng)病毒。等速梯度以及長(cháng)液柱可增進(jìn)分離能力,適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。
B.梯度柱制備:
梯度液柱可以用手工或梯度儀制備
半注法:
為縮減離心時(shí)間,或分離樣品較少可用半注法:下半管鋪置梯度介質(zhì),中間加樣品,上面鋪Buffer或液體石臘油。
(4)、加樣方法與加樣量:
將樣品加到梯度液柱上,針尖和離心管成45-60°角度,慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去,對于DNA一類(lèi)易斷的脆弱樣品,應該用孔徑較大的移液管代替針頭,以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱小密度的1/10(W/W)。
(5)、轉子的選擇與效應:
(6)、分離區帶的回收及檢測
離心后所形成的區帶樣品的回收方法基本有四種:
a.穿刺法
穿刺離心管底部,使梯度溶液滴出,將一具有合適閥門(mén)的蓋帽放在離心管頂,可控制滴出速度。
b.虹吸法:
將一毛細管輕輕插入管底,盡量防止梯度抖動(dòng),用微量泵逐漸滴取,以量滴數或體積部分收取。
c.加壓法:
通過(guò)一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部,部分收集換出的溶液。
d.切割法:
采用專(zhuān)用的切割刀切割所需區帶。