冷凍干燥機(jī)的應(yīng)用之微生物細(xì)菌的儲(chǔ)存方法
好氧菌冷凍干燥管的制備
1、安瓿管準(zhǔn)備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí),先用2%鹽酸浸泡過(guò)夜,自來(lái)水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標(biāo)簽,標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間,加入脫脂棉塞后,121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。
2、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí),應(yīng)注意其濃度及pH值,以及滅菌方法。如血清,可用過(guò)濾滅菌;牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100℃間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用。
3、凍干樣品的準(zhǔn)備
在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期,進(jìn)行純度檢查后(參見(jiàn)科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》(試行)),與保護(hù)劑混合均勻,分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長(zhǎng)的毛細(xì)滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物,應(yīng)離心去除培養(yǎng)基,然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻,再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短,**在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。
4、預(yù)凍
一般預(yù)凍2小時(shí)以上,溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi),開始冷凍干燥,時(shí)間一般為8-20小時(shí)。
6、真空封口及真空檢驗(yàn)
將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì),然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測(cè)定儀測(cè)定真空度。
7、保藏
安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。
8、質(zhì)量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查,如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。
厭氧菌冷凍干燥管的制備
主要程序與需氧菌操作相同,注意保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備,保護(hù)劑使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右,脫氣后放入冷水中急冷,除掉保護(hù)劑中的溶解氧。
復(fù)蘇方法
先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,將安瓿管頂部燒熱,用無(wú)菌棉簽沾冷水,在頂部擦一圈,頂部出現(xiàn)裂紋,用挫刀或鑷子頸部輕叩一下,敲下已開裂的安瓿管的頂端,用無(wú)菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊,使用無(wú)菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上,進(jìn)行適溫培養(yǎng)。